胃癌（Gastric cancer, GC）是来源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。主要包括胃腺癌、胃肠道质瘤、胃肠道平滑肌肉瘤、胃肠类癌、胃肠道淋巴瘤，其中胃腺癌最为常见，占90%以上。胃癌是我国及发病率最高的恶性肿瘤之一。围手术期治疗，包括化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等手段，可以减少全身肿瘤负荷，降低肿瘤分期，从而增加肿瘤根治性切除的可能性。目前临床上以放化疗等传统治疗手段为主但疗效有限.近年来,靶向治疗与免疫治疗等新型治疗手段取得了突破性进展,目前有2类靶向药物(anti-HER2, anti-VEGFR)及免疫检查点抑制剂（anti-PD-1）在胃癌中批准[1]，但远不能满足临床的需求。

1.病因与发病机制

胃癌病因和发病机制是多因素的，主要危险因素包括幽门螺杆菌感染、环境因素、饮食因素、遗传因素、癌前状态等。幽门螺杆菌是世界上最常见的细菌感染之一。它会引起十二指肠和胃溃疡以及慢性胃炎。幽门螺杆菌感染显著增加胃腺癌的风险。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将幽门螺旋杆菌归类为I类致癌物。细菌生活在胃的粘膜内层，可引起慢性炎症（胃炎）。这种炎症可导致促进癌症发展的DNA损伤。幽门螺杆菌与70%以上的胃腺癌有关。胃癌患病风险增加与高盐和各种盐腌制食品等摄入过多以及蔬菜、水果、奶类和维生素A 摄入较少有关。约有10%的胃癌病例出现家族聚集性，称为遗传性弥漫性胃癌，由CDH1基因突变引起。此外，癌前疾病包括慢性萎缩性胃炎、胃息肉、胃溃疡、术后残胃等与胃癌的发生也密切相关。

2.流行病学

在近多年来胃癌的发病率和死亡率呈下降趋势。2020年GLOBOCAN癌症统计数据表明，胃癌发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位。男性胃癌发病率是女性的2倍。东亚、东欧及南美地区胃癌发病率较高，北美及北欧地区胃癌发生率较低[2]。我国是胃癌大国，发病率和死亡率均高居恶性肿瘤第3位。由于胃癌的早期症状不典型、筛查体系不完善，我国约60%以上胃癌患者确诊时已为局部晚期或进展期，5年生存率不足30%。因此，我国胃癌现状可以用基数大、分期晚、预后差进行概括。

3.临床表现

早期胃癌患者常无特异的症状，随着病情的进展可出现类似胃炎、溃疡病的症状，主要有：1）上腹饱胀不适或隐痛，以饭后为重；2）食欲减退、嗳气、返酸、恶心、呕吐、黑便等。进展期胃癌除上述症状外，常出现：体重减轻、贫血、乏力。3）胃部疼痛，如疼痛持续加重且向腰背放射，则提示可能存在胰腺和腹腔神经丛受侵。胃癌一旦穿孔，可出现剧烈腹痛的胃穿孔症状。4）恶心、呕吐，常为肿瘤引起梗阻或胃功能紊乱所致。贲门部癌可出现进行性加重的吞咽困难及反流症状，胃窦部癌引起幽门梗阻时可呕吐宿食。5）出血和黑便，肿瘤侵犯血管，可引起消化道出血。小量出血时仅有大便潜血阳性，当出血量较大时可表现为呕血及黑便。6）其他症状如腹泻(患者因胃酸缺乏、胃排空加快)、转移灶的症状等。晚期患者可出现严重消瘦、贫血、水肿、发热、黄疸和恶病质。

4.临床分期

最常用来对胃癌进行分期的系统是美国癌症联合委员会（AJCC）的TNM分期系统。其中T代表肿瘤（Tumor），包括原发肿瘤在哪里，扩散到胃壁和临近器官有多深；N代表淋巴结（Lymph node），包括肿瘤是否扩散到淋巴结，如果有的话，扩散到了哪里的淋巴结和影响到了多少淋巴结；M代表转移（Metastasis），包括癌症是否转移到到身体其他部位，最常见的胃癌远端转移部位包括肝脏、腹膜和远处淋巴结。具体分期标准见表1。

表1.胃癌TNM分期。

5.胃癌分型

5.1组织分型

胃癌的组织学分型是以肿瘤的组织结构、细胞形态和分化程度为依据, 目前常用的病理形态学分类主要是Lauren分型和WHO分型。

Lauren分型是1965年由北欧病理学家Lauren提出, 将胃癌分为肠型、弥漫型以及混合型和未确定型[3]。肠型胃癌在胃癌高发区常见, 一般发病年龄较晚, 男性多见, 多发生在胃窦; 而弥漫型胃癌在低发区多见, 多见于青年女性, 胃体多发, 有遗传倾向性, 容易出现腹膜播散种植转移，预后更差。

WHO消化系肿瘤分类将胃癌分为5个主要分型和其他少见类型, 主要分型均为腺癌, 约占胃癌的95%, 起源于胃黏膜层的腺上皮, 包括乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、差黏附性癌(包括印戒细胞癌及其变异型)及混合型腺癌; 其他少见类型癌, 约占5%, 包括腺鳞癌、伴淋巴样间质癌(髓样癌)、肝样腺癌、鳞状细胞癌、绒毛膜癌与癌肉瘤、壁细胞癌、横纹肌样肿瘤、黏液表皮样癌、潘氏细胞癌、未分化癌、腺神经内分泌癌、内胚窦肿瘤、胚胎样癌、卵黄囊肿瘤及嗜酸细胞腺癌。但WHO分类不能反映细胞分化程度, 因此, 病理诊断中常结合分化程度进一步分型为高分化(1级)、中分化(2级)和低分化型(3级)。

5.2分子分型

随着基因组学、转录组学、代谢组学以及表观遗传等研究的开展,胃癌的分型逐渐从传统的组织病理学分型过渡到分子分型.尤其是从2013到2015年,杜克-新加坡国立大学(2013)[4],癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA, 2014)[5]以及亚洲癌症研究组(Asian Cancer Research Group, ACRG, 2015)[6]这三个研究中心通过结合新一代的测序技术相继发表了一系列的大样本胃癌分子分型研究数据.这些分型之间既有重叠又有各自独立的特点,对临床预后有重要的指导意义，并且揭示了多个潜在的针对不同分型的靶向治疗策略.以ACRG分型为例,提出了4个胃癌分子亚型:微卫星不稳定（MSI）型、微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）/上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）型,MSS/p53+型、MSS/p53-型。其中MSS/EMT型，多对应Lauren弥漫型，较其它亚型发病年龄显著偏低，分期较晚（Ⅲ或Ⅳ期），4种亚型中预后最差,复发率高到63%。该亚型基因突变频率低，常见钙黏蛋白E-cadherin/CDH1表达下调。

人胃癌细胞株HGC-27：源于一名未分化胃癌患者的淋巴结转移肿瘤体外培养构建而成。细胞呈多边形或短纺锤形，以单层粘附在玻璃表面。细胞培养在37度恒温培养箱，CO2浓度为5%，培养基为RPMI1640+10% 胎牛血清。细胞倍增时间约为17h。

荧光素酶表达载体:

载体类型：慢病毒基因表达载体

荧光标签:Firefly Luciferase

真核细胞筛选抗性：Puromycin

原核抗性：Ampicillin

图1. 荧光素酶表达载体图谱

NOD-scid IL2rγnull(NSG)小鼠:该品系是在NOD-SCID 品系基础上敲除Il2受体蛋白的γ链基因，缺失成熟T、B、NK细胞，是迄今免疫缺陷程度最高的小鼠，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义。

试剂：异氟烷

器械及仪器：台式离心机、移液器、细胞培养皿、细胞培养箱、异氟烷汽化器、半弯曲显微手术剪、持针器、直头无齿微型解剖、弯头解剖镊、16cm直头组织剪、棉签、酒精棉球、医用胶布、显微剪、聚苯乙烯泡沫塑料垫、1ml注射器（液体麻醉注射用）、4-0丝线（缝合腹膜）、小动物活体成像仪。

实验环境

细胞实验在细胞培养实验室生物安全柜中操作，动物手术在SPF动物实验室生物安全柜中操作。

实验操作规程

首先构建荧光素酶稳定表达HGC-27细胞，皮下接种小鼠，待小鼠成瘤后采集瘤块并原位接种到胃浆膜下层，后续在不同时间点观察原位成瘤和肿瘤转移情况。具体操作如下：

1）构建荧光素酶稳定表达HGC-27细胞。具体方法同上。

2）动物自由摄食摄水，进行常规称重；动物识别采取饲养笼卡片标记和耳号个体识别标记；左手固定住小鼠，右手持注射器在小鼠右侧腋下注射5×106/150µl荧光素酶稳定表达HGC-27；待皮下肿瘤块达到1cm3时，将小鼠脱颈处死，在生物安全柜取出肿瘤并剪成1mm3左右组织块用于原位接种。

3）左手固定住小鼠，右手持装有适量异氟烷的麻醉装置，将小鼠的口鼻部暴露在异氟烷气体中。麻醉过程中应持续观察小鼠的反应，掌握好麻醉深度。待完全麻醉后，将小鼠固定在手术台上，术中持续给予吸入麻醉，维持适当的麻醉深度。用剃毛机剔除小鼠腹部的毛发，用酒精消毒腹部后剪开皮肤和腹膜，暴露胃体，在显微镜下将1mm3肿块埋在胃浆膜下层；将胃复位后，随后依次用5-0和4-0的医用缝合线缝合腹膜和皮肤。缝合完毕后，消毒缝合口和周围皮肤，停止麻醉。

4）手术结束后将小鼠放在37度恒温加热垫上等待苏醒，最后将苏醒后的小鼠安置在干净的鼠笼中正常饲养、观察。

5）密切观察小鼠状态，每两周进行荧光活体成像并处死2只老鼠进行取材，分别进行组织荧光成像、HE染色、免疫组化分析。

1. 人胃癌HGC-27荧光素酶标记细胞的鉴定

HGC-27感染荧光素酶慢病毒后72h 添加Puromycin处理1周左右筛选稳定表达细胞，取1x106细胞/孔铺到6孔板，添加荧光素底物后室温孵育5min，利用小动物活体成像仪观察荧光水平（图5）。

图5.人胃癌HGC-27荧光素酶标记细胞的荧光水平检测。

2. 小鼠活体荧光成像检测肿瘤生长情况。

不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况。(A)所有老鼠的荧光活性均值（n=2-6 mice/time point）。(B)代表性小鼠的荧光成像结果。

图6.小鼠活体荧光成像检测肿瘤生长情况。

3. 不同组织荧光成像检测肿瘤生长及转移情况。

不同时间点小鼠活体成像后处死两只老鼠进行取材，随后对不同组织进行荧光成像观察肿瘤生长及转移情况。图7显示原位接种肿瘤后第8周小鼠不同组织荧光成像结果，分别在胃和肝脏中检测到肿瘤细胞。

图7.不同组织荧光成像检测肿瘤生长及转移情况。

4. 胃原位肿瘤H&E染色和Vimentin免疫组化染色

不同时间点小鼠活体成像后处死两只老鼠进行取材。(A) 胃原发灶H&E染色。（B）胃原位肿瘤Vimentin 免疫组化染色呈阳性。

图8.胃原位肿瘤H&E染色和Vimentin免疫组化染色

5.肝脏H&E染色和Vimentin免疫组化染色

不同时间点小鼠活体成像后处死两只老鼠进行取材，其中肿瘤接种后第8周检测到肝转移(图9)。(A) 肝H&E染色。（B）肝Vimentin 免疫组化染色。

图9.肝脏H&E染色和Vimentin免疫组化染色

尽管皮下移植瘤模型有很多优势，但皮下接种不能模拟患者体内肿瘤浸润情况，肿瘤很难发生转移；尾静脉注射肿瘤转移模型能部分模拟血行通路在全身生成多发转移灶，以肺转移为主，但在临床上多发生在转移晚期，并且不能模拟由于直接浸润、腹膜种植以及淋巴转移等导致的肿瘤转移情况，因此我们进一步建立原位移植模型。首先构建荧光素酶标记HGC-27细胞皮下接种小鼠，采集瘤块后原位接种到胃浆膜下层并在不同时间点观察原位成瘤和肿瘤转移情况。我们计划利用该模型研究肿瘤转移分子机理并寻找治疗新靶点。

评价方法：

1）细胞荧光素酶活性鉴定。

该模型利用荧光素酶慢病毒表达系统实现在肿瘤细胞中稳定地表达荧光素酶。

2）肿瘤成瘤及生长情况。

该模型利用小动物活体成像仪进行荧光活体成像、分离胃组织荧光成像以及胃原位H&E染色和免疫组化染色检测肿瘤成瘤及生长情况，结果显示原位肿瘤成功接种并且肿瘤随时间呈明显增长趋势。

3） 肿瘤转移情况

该模型利用小动物活体成像仪进行荧光活体成像、分离组织荧光成像以及H&E染色和免疫组化染色检测肿瘤转移情况，结果显示部分小鼠后期发生肿瘤肝转移。

评价指标：

主要指标：

1）细胞稳定表达高水平荧光素酶活性。

2）胃原位肿瘤接种成功并随时间呈增长趋势。

3）肿瘤是否转移到其它组织。

重要指标：小鼠活动、进食及体重变化。

本模型制作不涉及微生物。

实验中涉及到人胃癌细胞系的细胞均使用从公司购买的商品化人源胃癌细胞系，由实验室工作人员统一严格管理。实验操作严格遵守P2实验室个人防护及操作规范，相关实验在生物安全柜中进行，将剩余细胞、组织或者污染物置于废液桶内，作为医疗垃圾进行专门处理。

动物模型制备过程中遵循福利和各项管理度，并未传代，于SPF屏障环境下饲养，动物无逃逸。

模型制备完成后，在进行病理染色析对环境和生态并未产明显影响。

该模型技术方法和指标体系主要包括三个方面：

1) 细胞水平：构建稳定表达高水平荧光素酶活性的肿瘤细胞株。 2) 组织水平：不同组织荧光成像、H&E染色和免疫组化染色检测原位肿瘤成瘤、生长及转移情况。 3) 动物水平：荧光活体成像检测肿瘤成瘤、生长及转移情况。 胃癌原位移植瘤模型的报道与皮下移植模型相比较少。主要使用胃癌细胞系进行建模，使用原代肿瘤样本进行建模的报道很少。建模以原位接种组织块为主，但也有通过注射细胞悬液，但有文献报道后者的成瘤效果不及前者[20]；接种部位多样，包括粘膜层、粘膜下层、浆膜层、浆膜下层，其中以浆膜层和浆膜下层最为常见；接种方法包括悬挂法、包埋法等。我们选用了转移性较高的胃癌细胞系HGC-27, 通过包埋法将组织块接种到胃浆膜下层，原位肿瘤成瘤率高（8/8）,并且后期在部分小鼠（1/2）中观察到肿瘤肝转移。后续计划扩大接种小鼠数量并延长观察时间进一步分析肿瘤的转移情况。 原位移植肿瘤模型操作相对复杂,难度较大,原位成瘤及形成转移灶的时间较长,且在建模过程中影响实验结果的因素较多,如接种部位、瘤块大小、瘤块选取的部位及活性等。但能够最大程度的模拟肿瘤的生物学行为,如肿瘤的局部生长、浸润、腹膜种植、以及从原发部位脱落侵入血液循环并发生远处转移等过程,是研究肿瘤发生发展及转移较为理想的动物模型。